小鼠原代肝细胞是研究肝脏代谢、毒理学及药物筛选的重要体外模型。以下为经典的两步胶原酶灌注法分离及培养流程。
一、实验准备
-动物：6-8周龄雄性小鼠（肝细胞再生及耐受性较好），术前禁食不禁水12小时。
-灌注液：
-溶液Ⅰ（无钙Hanks液，含0.5mMEGTA，37℃）
-溶液Ⅱ（含0.05%Ⅳ型胶原酶、5mMCaCl₂的Hanks液，37℃）
-培养基：Williams’E培养基+10%FBS+1%双抗+4μg/mL胰岛素+10⁻⁷M。
-器械：手术剪、镊、24G静脉留置针、蠕动泵（流速1-3mL/min）、70μm细胞筛。
二、分离步骤（无菌操作）
1.麻醉与开腹：吸入麻醉小鼠，固定后腹部大十字切口，暴露门静脉及下腔静脉。
2.门静脉插管：用留置针穿刺门静脉主干，退出针芯，连接蠕动泵灌注溶液Ⅰ（流速2mL/min）。同时剪断下腔静脉，释放血液及灌注液。
3.两步灌注：
-预灌注：溶液Ⅰ灌注约50mL（约5分钟），至肝脏变为土黄色，去除血液。
-消化：换溶液Ⅱ灌注10-15mL（3-5分钟），见肝脏膨大、表面出现裂纹时停止。
4.细胞释放：小心摘取肝脏，放入含10mL预冷培养基的平皿中，用镊子撕开肝包膜，轻轻振荡使细胞脱落。
5.纯化：细胞悬液经70μm筛网过滤，50×g离心3分钟（2次），去除碎片及非实质细胞。台盼蓝染色检测活率（应＞85%）。
三、培养方法
-铺板：用含10%FBS的培养基重悬细胞，按5×10⁵/cm²密度接种于胶原包被的培养板。
-培养条件：37℃、5%CO₂，4-6小时细胞贴壁后换液，去除未贴壁细胞。
-维持：每24-48小时换液一次。原代肝细胞通常在24小时后出现典型多边形形态及双核，培养5-7天内保持主要肝功能（如白蛋白分泌、CYP酶活性）。
四、注意事项
-灌注速度及酶活性是关键：流速过快易损伤细胞，过慢则消化不均。
-所有溶液及器材保持37℃及无菌，操作控制在30分钟内完成。
-接种密度不宜过低，否则影响细胞间连接及功能维持。
该方法每只小鼠可获得2-5×10⁷个肝细胞，活率达标后可成功培养5-7天。
