特异性：优先选择经过WB验证的抗体（说明书标注“WB-verified"），避免交叉反应。
种属匹配：目标蛋白若为人类蛋白，优先选抗人源抗体；一抗与二抗来源需对应（如兔源一抗→山羊抗兔二抗）。
标记类型：HRP偶联二抗适合化学发光检测，荧光标记二抗适合荧光成像系统。
效价：抗体稀释比需参考说明书，过高浓度易导致背景过高，过低则信号弱。
WB抗体使用流程与注意事项：
常规使用步骤：
蛋白样品电泳分离→转膜（将蛋白转移至NC膜或PVDF膜）
封闭（5%脱脂奶粉或BSA，阻断非特异性结合位点）
一抗孵育：4℃摇床过夜（推荐）或室温孵育2-4h，之后用TBST洗膜3次
二抗孵育：室温摇床孵育1-2h，TBST洗膜3次
信号检测（化学发光底物显影或荧光扫描）
常见问题与解决方法：
无信号：抗体浓度过低、孵育时间不足、转膜失败→提高抗体浓度、延长孵育时间、优化转膜条件。
背景过高：封闭不充分、抗体浓度过高→延长封闭时间、降低抗体浓度、增加洗膜次数。
条带杂带多：抗体特异性差→更换经过WB验证的高特异性抗体，或增加一抗稀释比。
抗体的保存与稳定性：
未稀释抗体：通常分装后-20℃保存，避免反复冻融；部分抗体需4℃短期保存。
稀释后工作液：4℃保存不超过1周，建议现配现用。
避免抗体接触叠氮钠（NaN₃）：叠氮钠会抑制HRP活性，若封闭液含NaN₃，需洗膜后再孵育HRP偶联二抗。
