显微荧光光谱仪产品概述:
 

OmniFluo-FLIM系列显微荧光光谱仪由科研级正置显微镜，配合多波长光路转换机构，实现一套系统多波长激发的灵活应用，适应不同样品测试需求。

高精度平移台对样品做微米量级的步进控制，实现空间高分辨率扫描。样品发光有高效收光光路，由高速、高灵敏探测器接收，再由时间分辨精度达到16ps的时间相关单光子计数器来获得样品的荧光寿命。集成软件自动拟合个采集点荧光寿命，最终得到样品的寿命影像。

一、荧光和荧光寿命

分子包含多个单能态S0、S1、S2…和三重态T1…，每个能态都包含多个精细的能级。正常情况下，大部分电子处在*低能态即基态S0 的*低能级上，当分子被光束照射，会吸收光子能量，电子被激发到更高的能态S1 或S2 上，在S2 能态上的电子只能存在很短暂的时间，便会通过内转换过程跃迁到S1 上，而S1 能态上的电子亦会在极短时间内跃迁到S1 的*低能级上，而这些电子会存在一段时间后通过震荡弛豫辐射跃迁到基态，这个过程会释放一个光子，即荧光。

此外，亦会有电子跃迁至三重态T1 上，再由T1 跃迁至基态，我们称之为磷光。

二、显微荧光光谱仪荧光特性:

研究荧光特性时，主要在以下几方面进行分析：激发光谱，发射光谱、荧光强度、偏振荧光、荧光发光量子产率、荧光寿命等。其中荧光寿命（Fluorescence Lifetime）是指荧光分子在激发态上存在的平均时间（纳秒量级）。

荧光寿命测试

荧光寿命一般在几纳秒至几百纳秒之间，如今主要有两类测试方法：时域测量和频域测量时间稳定性实验测试曲线：

1、时域测量
由一束窄脉冲将荧光分子激发至较高能态S1，接着测量荧光的发射几率随时间的变化。其中目前广泛应用的是时间相关单光子计数，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)。

时间相关单光子计数(TCSPC) 实现了从百ps-ns-us 的瞬态测试，此方法对数据的获取依赖快速探测器和高速电路。用统计的方法计算样品受激后发出的*一个光子与激发光之间的时间差，也就是下图的START( 激发时刻) 与STOP( 发光时刻) 的时间差。由于对于Stop 信号的要求，所以TCSPC 一般需要高重复频率的光源作为激发源，其重复至少要在100KHz 以上，多数的光源都会达到MHz 量级；同时，在一般情况下还要对Stop 信号做数量上的控制，做到尽量满足在一个激发周期内，样品产生且只产生一个光子的有效荧光信号，避免光子对的出现。

2、频域测量
对连续激发光进行振幅调制后，分子发出的荧光强度也会受到振幅调制，两个调制信号之间存在与荧光寿命相关的相位差，因此可以测量该相位差计算荧光寿命。

左图为正弦调制激发光（绿色）频域显示，发射光信号（红色）相应的相位变化频域显示。

右图为对应不同寿命的调制和相位的频域显示。TM- 调制寿命，TP- 相位寿命。

显微荧光寿命成像技术（FLIM）。

显微荧光寿命成像技术（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一种在显微尺度下展现荧光寿命空间分布的技术，由于其不受样品浓度影响，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，目前在生物医学工程、光电半导体材料等领域是一种重要的表征测量手段。

FLIM 一般分为宽场FLIM 和激光扫描FLIM。

宽场FLIM（Wide Field FLIM,WFM）

该技术是用平行光照明并由物镜聚焦样品获得荧光信号，再由一宽场相机采集荧光成像。宽场FLIM 常用于快速获取大面积样品成像。时域或是频域寿命采集都可以应用在宽场成像FLIM 上。宽场FLIM 有更高帧率和低损伤的优势。

2 激光扫描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）

激光扫描FLIM 是针对选定区域内的样品逐点获取其荧光衰减曲线，再经过拟合*终合成荧光寿命图像。相比宽场FLIM，其在空间分辨率、信噪比方面有更大的优势。扫描方式有两种：一种是固定样品，移动激光进行扫描，一种是固定激光，电动位移台带动样品移动进行扫描。