分子杂交的概念和基本原理

一、分子杂交仪的概念：

分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

二、分子杂交基本原理：

(一）DNA变性 ：

DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等） 。

1、DNA变性的方法：

1)加热；

2)改变DNA溶液的pH；

3)有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。

2、增色效应：DNA在260nm处有吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。

3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。

4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature，Tm）。因此Tm是指消光值上升到消光值一半时的温度。

5、分子杂交仪影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：

1) 部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。

2) 部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性 ；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。

6、DNA中的GC含量与Tm值关系：

Tm = 69。3+0。41 × % （G+C）

对于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（G+C）+2（A+T）

实验表明DNA分子中（G+C）克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系。

（二）复性：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation） 。

退火：通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。

复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，则不能复性。

影响复性速度的因素：

1、DNA浓度：愈高，复性速度也愈快。

2、DNA片段的大小：DNA片段愈大，扩散速度愈低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此，在复性实验中，有时将DNA切成小片段，再进行复性。

3、温度：过高不利于复性。

4、分子杂交仪溶液的离子强度：通常盐浓度较高时，复性速度较快。

5、DNA顺序的复杂性；简单的分子复性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互补识别很快，故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究，可以了解DNA顺序的复杂性。

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