荧光寿命成像显微镜

用于分析荧光寿命的相量分析方法不需要任何拟合。Phasor FLIM（荧光寿命成像显微镜）提供了寿命分布的二维图形视图。该图形视图使任何观察者都能快速区分和分离FLIM图像中的不同寿命种群。相量FLIM分布的解释很简单。因为每个物种都有特定的相量，所以可以在单个像素内解析多个分子物种。

图1：左：用Alexa555-鬼笔环肽和H2B mCherry标记的细胞。使用FLIM相量执行分离。右：相量图清楚地显示了两种分布。图片由德国康斯坦茨大学生物学系MartinStöckl博士提供。

相量图如何生成？

当使用时间分辨单光子计数（TCSPC）系统获取数据时，相量FLIM分布是从傅立叶变换中得出的（Digman等，2008）。图像中的每个像素对应于相量图中的一个点。

图2：FLIM图像和相量图之间关系的示意图。图像中的每个强度像素值在相量图中都有一个对应的点。

图3：相量图，带有“通用圆”。还显示了用于任意寿命测量的水平（g）和垂直（s）分量。

规则：相量的代数

相量方法中只有很少的规则，它们使寿命分布的解释变得简单。最重要的三个如下所示（E.Gratton，2018）。

1. 单指数寿命位于圆线上。

   

   图4：通用圆线上的单指数寿命

   
   

2. 多指数寿命位于通用圆内，是其单个指数寿命成分的线性组合

   
   

   图5：圈内的多指数寿命。

   
   

3. 一种用于多指数寿命（实验测量）的线性组合的比例决定的组分的分数（f 1和f 2从他们的两个单指数寿命）（τ 1和τ 2）。

   
   

   
   

   图6：由一个多指数寿命的线性组合之比确定的两个单指数寿命。

使用相量的优势

Phasor FLIM是一种非常的分析工具，可用于分子种类分离和FRET分析，尤其是在供体具有多指数寿命（这是CFP [蓝绿色荧光蛋白]的典型特征）时（Caiolfa等人，2007）。此外，相量FLIM与STED相结合，可让您使用更少的STED功率来达到相同的分辨率（Lanzanò等，2015）。

图7：左图：用具有FLIM功能的SP8 STED系统成像的加塔珠。右图：通过在相量图中突出显示使用寿命长的像素，可以提高STED图像的分辨率。