活体成像D-荧光素钾盐
1CAS NO：115144-35-9
2化学名：4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt,D-Luciferin firefly,potassium salt
3分子式：C11H7N2O3S2K
4分子量：318.42 g/mol
5纯度：＞99%(HPLC)，分子生物学级（超纯）
6外观：浅黄色至黄色粉末7）溶解性：溶于水（60 mg/ml）
使用方法：
A．体外生物发光检测
1储存液制备用蒸馏水溶解D-荧光素钾盐，配制成15mg/ml的储存液（100×），混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。建议使用的工作液浓度为150µg/ml（相当于468µM）。
2荧光素酶反应缓冲液制备配方【1×，参考Yuichi Oba,et al.,2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250µM CoA，150µM ATP。具体缓冲液组成可参考其他文献资料来调整。按照以上配方制备荧光素酶反应缓冲液（2×）。
3收集细胞裂解上清（荧光素酶表达）根据需要检测的细胞类型，选择合适的裂解液进行细胞裂解，离心收集上清后续检测待用。
4萤火虫荧光信号检测
【注①】：萤火虫荧光信号的检测方法大体上取决于冷光测定仪（luminometer）类型（是手动型荧光计、单管注射型或者酶标板读数型荧光计）。根据特定发光测定仪，来考虑注射用量和程序设置。
【注②】：需设置不含荧光素酶的孔（用作阴性对照），以测定背景荧光。
例：注射式冷光测定仪（injectible luminometer，单样或微孔板，200µl终体积）。
a吸取100µl荧光素酶反应缓冲液（2×）到一干净的冷光测定仪比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）。
b吸取50~98µl裂解上清到皿或孔内。
c如果有需要，用水来补足使得总体积到198µl。
d设置程序注射2µl荧光素储存液（使工作浓度150µg/ml），程序：2~5秒延迟（delay），之后10s测定。
B．活体成像分析
1用无菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-荧光素（钾盐）工作液（15mg/ml），0.2µm滤膜过滤除菌。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。一旦使用，放到4℃解冻，保持冰冷且避光。
2注射量取决于注射方式，具体如下：注射方式剂量静脉注射（25-27 gauge针头）按10µl/g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液腹腔注射（25-27 gauge针头）按10µl/g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液肌肉注射（27 gauge针头）50µl，浓度为1-2mg/ml荧光素工作液鼻内注射（pipette）50µl，浓度为3mg/ml荧光素工作液。
3注射入体内10-20 min（待光信号达到较好的稳定平台期），再进行成像分析。注：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。
