发酵过程无菌状况的检测

发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果作为依据进行判断。在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。

目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有以下几种：

1.显微镜检查法（镜检法）

通常用革兰氏染色法对样品进行染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。此法是检查杂菌简单、直接、常用的方法。

2.平板划线培养或斜面培养检查法

先将制备好的平板置于37C培养箱保温24h，检查无菌后将待测样品在无菌平板上划线，分别于37C、27℃进行培养，般在8h后即可观察，连续3次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。有时为了提高检测灵敏度，也可将待检样品先置于37C培养6~8h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。

噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基倒平板，待凝固后，将上层培养基熔解并保持40℃，接入生产菌作为指示菌和待测样品混合后迅速倒入底层平板上，置培养箱中12~20h保温培养，观察有无噬菌斑。

3.肉汤培养法

将待检样品接入经灭菌并经过检查无菌的葡萄糖酚红肉汤培养基（0.3%牛肉膏，0.5%葡萄糖，0.5%氯化钠，0.8%蛋白胨，0.4%酚红溶液，ph7.2）中，于37C和27C分别培养24h，观察颜色变化（连续3次由红色变为黄色或产生混浊，可定为染菌），并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。

4.发酵过程的异常现象观察法

可根据发酵过程出现的异常现象，如溶解氧、ph、排气中的CO2含量以及微生物菌体的酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。

特定的发酵过程具有定的溶解氧水平，而且在不同的发酵阶段，溶解氧的水平也不同，如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常变化，般就是发酵染菌的表现。污染杂菌按照对氧的需求可分为两类，即好氧菌和非好氧菌。当受到好氧杂菌污染时，溶解氧的变化是在短时间内下降，直至为零，且在较长时间内不能回升；当受到非好氧杂菌污染时，抑制生产菌的生长，降低溶解氧的消耗，使溶解氧升高。

对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出气体中的CO2的变化是有规律的。染菌后，糖耗加快，CO2含量增加；被噬菌体感染后，糖耗降低，CO2的含量随之降低。因此，可以根据CO2的含量异常变化来判断染菌。