技能训练2固定床反应器发酵生产L-（+）-乳酸-新型发酵技术

、生产原理

L-（+）-乳酸是种重要的有机酸，具有巨大的市场潜力。工业化生产乳酸，通常以淀粉为原料采用细菌发酵，得到DL混合型乳酸，且相对成本较高。米根霉发酵所得乳酸光学纯度高，L-（+）-乳酸纯度达98.5%以上，而且可以共利用五碳糖和六碳糖，所需营养源简单，不必使用酵母提取物，仅以NH，NO，或尿素为氮源；采用固定化细胞浸没式膜生物反应器技术实现乳酸的连续发酵，可显著政善乳酸发酵过程。

二、主要材料及试剂

1.菌种

米根霉（OX1），筛选自牛津大学工程系实验室。

2.培养基

种子培养基：葡萄糖 60g，NH，NO，2.0g，NaH:PO，3.0 g，KFH，PO，2.0g，M9SQ，7H2O 0.25g，ZnSO，0.05g。

发酵培养基：葡萄糖100g，其他物质含量同种子培养基。

3.反应器

纤维固定床反应器系统由个5L发酵罐和个纤维固定床组合而成。纤维固定床采用个不锈钢圆柱形框体，四周缠绕层脱脂纱布，利用框体上纱布的缠绕面积不同来调节固定化面积。沉浸式膜生物反应器系统由个中空纤维膜组件与纤维固定床组合而成，通过在中空纤维膜端口施加的负压使乳酸及小分子物质通过膜孔，而将菌体和其他高分子物质截留，以保持膜反应器内高的菌体浓度，如图7-1所示，

三、方法与步骤

1.种子摇瓶培养

1L自加工摇瓶中装入150mL种子培养基，1次添加碳酸钙3.5g，接种量为10%，孢子浓度为3×10*个/mL；培养条件为温度34℃，转速200r/min，时间20h，使菌体固定化成菌球。

2.发酵发酵培养

在5L全自动发酵罐内加入4L培养基，接种量为体积的7.5%，通气量为0.06~0.3m"/h，罐压为0.01MPa，发酵温度为34℃，搅拌速率为100r/min。采用8mol/L NaOH自动控制发酵过程pH（5.8±0.1），消泡剂采用多批次流加，以熊内出现较多泡沫作为滴加前提，每次滴加2～3滴即可。发酵过程中每5h取样1次，每次取样20ml，测定发酵液中葡萄糖、乳酸和富马酸的浓度。

3.分析方法

①葡萄糖测定。素外分光光度计法，

②乳酸和副产物富马酸测定。采用HPIC分析。检测条件：DATD检测器，检测波长210nm；GEMODS色谱柱（4.6mm×150mm，5um）；柱温25℃；流动相为0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH2.6），流速为1.0mL/min，

③L-（十）-乳酸测定。1-乳酸检测试剂盒，L-乳酸光学纯度（%）为100[1]/（[1.]+

[D]），其中[L]、[D]分别为发酵液中L-乳酸和-乳酸含量。

④于菌重（DCW）测定。发醉至终点时，取出菌丝床，将菌体剥离，并日使用滤纸过滤发酵液中常丝，然后将菌体放入干燥箱中，在50℃下下燥10h，至恒重，称量得DCW。⑤得率计算。Txw=菌体干重（g）/葡萄糖消耗量（g），T=产物生成量（g）/葡萄糖消耗量（g），