半自动多肽合成仪的工作原理基于固相多肽合成法（SPPS），通过自动化控制关键反应步骤，实现多肽链的逐步构建。其核心流程与自动化控制逻辑如下：
一、固相合成法基础原理
1.载体固定
将第一个氨基酸的羧基端（C端）通过共价键连接到不溶性树脂载体上（如交联聚苯乙烯、聚酰胺等）。树脂作为“固体支架”，使后续反应在固液两相界面进行。
2.保护基策略
氨基保护：采用Fmoc（9-芴甲氧羰基）或Boc（叔丁氧羰基）基团保护氨基，防止副反应。
侧链保护：根据氨基酸特性选择酸或碱不稳定的保护基。
羧基活化：后续氨基酸的羧基需通过活化剂（如HBTU、HATU）转化为活性酯或酸酐，才能与树脂上的氨基形成肽键。
3.逐步缩合
从C端向N端逐个添加氨基酸，通过“脱保护→活化→偶联→洗涤”循环，延长肽链至目标长度。
二、半自动多肽合成仪的核心工作流程
1.树脂预处理
将树脂装入反应柱，用溶剂（如DMF、DCM）洗涤以去除杂质，并平衡反应环境。
2.脱保护（Deprotection）
Fmoc法：用碱性溶剂（如20%哌啶/DMF）去除Fmoc保护基，暴露游离氨基。
Boc法：用酸性试剂（如50% TFA/DCM）脱除Boc基团。
半自动控制：通过程序控制试剂泵输送脱保护液，并设定反应时间（通常5-15分钟）。
3.活化与偶联（Coupling）
将下一个氨基酸、活化剂（如HBTU）和碱（如DIPEA）混合，形成活性中间体。
活性中间体与树脂上的游离氨基反应，形成肽键。
半自动控制：
试剂泵按比例输送氨基酸、活化剂和碱溶液。
反应时间根据氨基酸类型调整（如疏水性氨基酸需延长反应时间）。
部分仪器配备搅拌装置（如氮气鼓泡）促进固液混合。
4.洗涤（Washing）
用溶剂（如DMF）多次洗涤反应柱，去除未反应的试剂和副产物（如双保护氨基酸、活化剂残留）。
半自动控制：通过程序控制洗涤溶剂的输送和排放，确保清洗。
5.循环重复
重复“脱保护→活化→偶联→洗涤”步骤，直至合成目标序列的多肽链。
6.切割与脱保护（Cleavage）
用强酸（如TFA/TIS/H₂O混合液）将多肽从树脂上切割下来，同时去除侧链保护基。
反应时间通常为2-4小时，需严格控制条件以防止副反应（如天冬酰胺脱氨）。
半自动控制：通过程序控制切割试剂的输送和反应温度（如室温或低温）。
7.纯化与收集
切割后的多肽溶液经C₂H₅OC₂H₅沉淀、离心后得到粗品。
进一步通过HPLC纯化，获得高纯度多肽。
半自动支持：部分仪器可集成切割液收集模块，减少人工操作。
三、技术优势与应用场景
1.优势
灵活性：可自定义合成序列，适应复杂多肽（如含修饰基团或非天然氨基酸）。
成本效益：相比全自动仪器，设备成本低，适合预算有限的实验室。
教育价值：通过手动操作关键步骤，帮助研究者理解多肽合成原理。
2.典型应用
合成短肽（<20个氨基酸）用于结构生物学研究。
制备多肽文库用于药物筛选（如抗原表位肽）。
合成标记多肽（如荧光标记）用于分子互作分析。
